近日,美国德克萨斯大学埃尔帕索分校(TheUniversityofTexasatElPaso,UTEP)的李秀军(XiuJunLi)团队报道了一种基于光热效应的基因定量检测方法,仅用温度计作为信号读取工具,利用纸芯片作为载体,实现了对传染病(肺结核)病原体DNA的快速、灵敏、低成本的检测。病原体感染经常造成疾病在全球范围内的传播,对健康造成重大威胁。肺结核(tuberculosis,TB),作为最致命的传染病之一,位居单一传染疾病致死率首位,每年死亡人数超过多万。中国的估算结核病新发患者数为86.6万(年)。肺结核是由病原体细菌——结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)——感染人体引起的,传统的肺结核诊断方法依赖于临床检测、痰涂片镜检、细菌分离和培养等,这些方法步骤繁琐、耗时较长。近年来,基于MTB的分子检测方法迅速发展,利用比色、电化学、荧光、化学发光等技术,通过聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)等DNA扩增方法,实现了对MTB的DNA分子的快速、定量检测。然而,此类方法依赖于昂贵的分析检测仪器和专业技术人员,不利于结核病的即时检测(point-of-caretesting,POCT),限制了其在欠发达地区的应用和推广。为解决以上问题,该团队研发了一种新型的光热生物传感器用于肺结核诊断,仅利用温度计和纸芯片,MTB的DNA分子可被定量检测,检测过程简单、低成本,且不依赖于其他传统分析仪器。该研究首先通过一步法修饰纸表面(图1),将DNA捕获探针(captureDNAprobe)固定在纸芯片载体上;之后,通过三明治DNA杂交手段,目标物MTB的DNA和金纳米颗粒修饰的检测探针(goldnanoparticle(AuNP)-modifieddetectorprobe)也被有选择性地固定在纸芯片上;加入底物(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)后,金纳米颗粒作为催化剂参与TMB氧化反应,体系由无色变为蓝色;由于光热效应,产物ox-TMB在近红外激光(nm)的照射下产热,导致体系温度升高,进而将目标物DNA分子的信息转化为温度信号;仅依靠温度计作为信号读取器,MTB的DNA分子即可被定量检测。图1.基于光热效应和纸芯片的DNA检测原理示意图。该工作进一步探究了不同反应条件对光热温度信号的影响,包括底物TMB和催化剂AuNPs的浓度、激光照射时间等。以TMB为例,实验发现(图2),温度信号受底物浓度影响。在其他条件固定的情况下,随着TMB的浓度增加,可见光(nm)和近红外区域的吸光度首先呈上升趋势,激光照射5分钟后,温度升高了15.0℃,这是由于作为比色和光热探针的ox-TMB的产量随之增加;当TMB浓度继续增加(高于0.25mg/mL),由于催化剂的量有限,产物ox-TMB的浓度趋于饱和,可见光和近红外吸光度、温度信号均保持稳定。因此,为达到最佳检测条件,底物TMB的浓度优化为0.25mg/mL。依照类似的方法,其他反应条件也依次优化。图2.光热检测体系中底物TMB浓度的优化:(A)可见-近红外吸收光谱、(B)nm和nm处吸光度、(C)温度升高值随底物浓度的变化。基于以上优化条件,该体系被应用于定量检测MTB的DNA分子。实验结果证明,随着目标物DNA浓度的增加,纸芯片载体由无色变为蓝色(图3(A)(a-b));同时,在近红外激光照射3分钟后,体系温度逐渐上升至ΔT~17.0℃。在浓度范围0.1-50μM,温度上升值与DNA浓度呈对数增长趋势,检测限可达39nM(即0.58μg/mL),其灵敏度远高于已报道的比色检测结果(例如10μg/mL),该检测过程仅依靠温度计,避免使用任何昂贵的分析仪器。此外,利用染色溶液作为血液样品的替代(图3(A)(c)),实验结果显示,常规比色法易受着色样品的颜色干扰,而光热检测方法基于温度的变化,不受其干扰。而且,通过测试不同种类的病原体DNA,例如TBknockoutDNA、M.smegmatis、DNAmixture(M.smegmatis和TBknockout)、M.marinum等,此检测体系表现出了较好的特异性,可以区分高度相似的分枝杆菌(MTB和M.marinum)。该研究为病原体DNA检测提供了一种快速(检测时长2h)、灵敏、低成本(单个纸芯片成本低至$0.08)、且不依赖于昂贵分析仪器的新方法,为传染性疾病的即时检测提供了广阔的应用前景。图3.光热检测体系用于对结核杆菌目标物的定量、特异性检测结果:(A)温度升高值随MTB的DNA浓度的变化;(a-b)不同DNA浓度的检测结果,(c)利用着色溶液的检测结果;(B)目标物和不同干扰物在检测体系的温度升高值。这一研究成果近期发表在AnalyticalChemistry上,文章的第一作者周婉,目前博士在读。原文(扫描或长按


转载请注明地址:http://www.zhongjiefenga.com/zjfjb/6301.html